适配双抗体夹心法 ELISA：最终获得捕获单抗（包被用）+ 检测单抗（后续 HRP 标记）一对配对单克隆抗体，全文分阶段细化操作、关键参数、判定标准、常见问题。
总流程主线
抗原制备与鉴定 → 动物免疫（小鼠）→ 免疫效价血清检测 → 细胞融合（脾细胞 + 骨髓瘤细胞）→ HAT 选择性培养 → 初次 ELISA 筛选阳性杂交瘤孔 → 有限稀释亚克隆（单克隆化）→ 多轮亚克隆直至单克隆稳定株 → 细胞株建库冻存 → 腹水制备 / 细胞上清大规模培养 → 抗体纯化 → 抗体浓度、纯度、活性鉴定 → 配对验证（确认可用于 ELISA 夹心法）
一、第一步：免疫原抗原制备与质控（免疫前提）
1. 抗原要求
ELISA 用抗原优先重组表达蛋白，天然抗原次之；
纯度：SDS-PAGE 考染纯度≥90%；
定量：BCA/ Bradford 准确定量；
去除内毒素（避免小鼠炎症死亡）；
小分子无免疫原性需载体蛋白偶联（BSA/OVA）。
2. 佐剂配制
初次免疫：弗氏完全佐剂 CFA（含灭活结核杆菌，强免疫刺激）
加强免疫：弗氏不完全佐剂 IFA
3. 抗原 - 佐剂乳化
抗原溶液与佐剂 1:1 体积混合，注射器对推乳化，滴入清水呈油滴不扩散即为乳化合格。
二、小鼠免疫（BALB/c 雌性小鼠，6~8 周龄，最常用）
方案（标准 5 针免疫程序）
首免（第 0 天）
多点皮下注射：颈后、腹股沟、背部多点，总抗原量 50~100μg / 只，CFA 乳化。
二免（第 14 天）
IFA 乳化同剂量抗原，皮下多点注射。
三免（第 28 天）
IFA 乳化，皮下加强。
尾静脉采血测血清效价（第 35 天左右）
间接 ELISA 检测小鼠血清抗抗原抗体滴度：
包被抗原 1μg/mL，梯度稀释血清，OD450＞阴性对照 2.1 倍判阳性；
效价≥1:10000 说明免疫成功，可准备冲击免疫。
冲击免疫（融合前 3 天，第 42 天）
不加佐剂，抗原溶于 PBS，腹腔注射 100μg 纯抗原，快速激活脾脏 B 淋巴细胞，提升融合阳性率。
若效价偏低：追加 1~2 针 IFA 加强，间隔 14 天。
三、骨髓瘤细胞复苏与培养（SP2/0-Ag14 细胞系）
1. 细胞培养条件
培养基：基础 RPMI 1640 + 10% 胎牛血清 FBS + 双抗（青霉素 + 链霉素）
37℃、5% CO₂饱和湿度培养。
2. 融合前准备
细胞处于对数生长期，活率＞95%；
提前 2~3 天传代，避免老化、成团；
融合当天收集细胞，离心洗涤 2 次，备用。
四、细胞融合（PEG 介导融合，核心步骤）
1. 取材脾细胞
颈椎脱臼处死免疫小鼠，无菌取脾脏；
研磨过 200 目筛网制成单细胞悬液，RPMI 洗涤离心 3 次，去除红细胞与碎片。
2. 细胞配比
脾细胞 : SP2/0 骨髓瘤细胞 = 5:1 ~ 10:1，混合于同一离心管。
3. PEG 促融（关键）
弃上清，轻弹管底使细胞松散；
1min 内匀速滴加50% PEG1500 1mL（37℃预热），边加边轻柔转动；
静置 90s（严格计时，PEG 毒性大会杀死细胞）；
缓慢加无血清 RPMI 终止 PEG 作用，逐步稀释；
离心弃上清，用HAT 选择性培养基重悬细胞。
4. 铺板
96 孔细胞培养板，每孔加细胞悬液 200μL；
37℃CO₂培养箱静置培养。
五、HAT 选择性培养原理与换液
1. HAT 成分作用
H：次黄嘌呤
A：氨基蝶呤（阻断细胞从头 DNA 合成通路）
T：胸腺嘧啶核苷
骨髓瘤细胞：缺失 HGPRT 酶，无法利用补救合成，在 HAT 中自身无法增殖死亡；
未融合脾细胞：体外培养数天自然凋亡；
杂交瘤细胞：兼具脾细胞 HGPRT + 骨髓瘤无限增殖能力，可存活扩增。
2. 换液程序
第 3~5 天：半量换液 HAT 培养基；
第 7~10 天：可见孔内针尖大小杂交瘤细胞克隆；
第 10~14 天：换成HT 培养基（去掉氨基蝶呤），降低毒性；
克隆长至孔底 1/10 面积时，即可取上清做 ELISA 初筛。
六、初次阳性孔筛选（间接 ELISA，筛能结合抗原的杂交瘤）
1. 板条包被
靶抗原用碳酸盐包被液稀释至 1μg/mL，100μL / 孔，4℃过夜；
PBST 洗板，5% BSA 37℃封闭 1h。
2. 加样
每孔取杂交瘤上清 100μL，37℃孵育 1h；
设阳性小鼠免疫血清、空白培养基、SP2/0 上清作为对照。
3. 二抗显色
HRP 标记羊抗小鼠 IgG，孵育→洗板→TMB 显色→硫酸终止，测 OD450。
OD 值≥阴性 2.1 倍判定为阳性孔，标记孔位。
七、有限稀释法亚克隆（获得单克隆细胞株，最关键纯化步骤）
初次阳性孔内是多个杂交瘤混合克隆，必须亚克隆分离单细胞株，否则抗体分泌不稳定、易丢失阳性。
标准有限稀释操作
吸出阳性孔细胞，计数；
用 HT 培养基梯度稀释，按0.5 个细胞 / 孔铺 96 孔板；
培养 7~10 天，显微镜标记单克隆孔（孔内仅 1 个细胞群落）；
再次取上清 ELISA 检测阳性；
连续亚克隆 2~4 轮，直至所有单克隆孔 100% 阳性，且孔间 OD 差异极小，视为稳定单克隆细胞株。
亚克隆合格判定
连续两轮亚克隆无阴性孔，分泌抗体性状稳定，方可建株冻存。
八、细胞株保种冻存
冻存液：70% RPMI+20% FBS+10% DMSO
程序降温后转入 - 80℃冰箱短期保存，长期置于液氮罐。
每株细胞冻存 10~20 支种子细胞，防止污染 / 丢株。
九、单克隆抗体大规模制备两种路线
路线 A：体内诱生腹水法（产量极高，工业常用）
BALB/c 小鼠腹腔提前注射 0.5mL 石蜡油，预处理致敏腹腔；
7 天后腹腔注射单克隆杂交瘤细胞 5×10⁶~1×10⁷ 个 / 只；
7~14 天小鼠腹部明显膨大，无菌抽取腹水；
腹水离心去除油脂与细胞沉淀，上清即为粗抗体腹水。
单只小鼠可获腹水 5~15mL，抗体浓度 1~10mg/mL。
路线 B：体外细胞培养上清（无小鼠源杂质，适合临床级）
细胞放大至细胞瓶 / 生物反应器培养，收集上清；
缺点：抗体浓度低（10~50μg/mL），体积大，纯化工作量大。
十、单克隆抗体纯化（Protein A/G 亲和层析首选）
1. 预处理
腹水 / 培养上清 12000rpm 离心，0.45μm 滤膜过滤除杂。
2. 亲和柱结合
平衡液 PBS 过柱，样品上柱，IgG 特异性结合 Protein A/G 填料；
PBST 洗去杂蛋白、脂类、非特异性蛋白。
3. 洗脱
pH2.7 甘氨酸盐酸洗脱液洗脱结合抗体，立即用中性 Tris 中和 pH，避免抗体变性。
4. 脱盐换液
超滤管 / 透析袋置换至 PBS，浓缩定容。
十一、抗体全面质控鉴定（ELISA 试剂盒使用前必做）
浓度检测：Bradford/BCA 测蛋白浓度；
纯度检测：SDS-PAGE 还原电泳，出现重链 55kDa、轻链 25kDa 两条主带，无杂带；
亚型鉴定：小鼠 Ig 亚型试纸，确定 IgG1/IgG2a/IgG2b 等；
结合活性：间接 ELISA 滴定抗体效价；
配对筛选（夹心法关键）
将不同单抗分为两组：
一组包被酶标板做捕获抗体；
另一组 HRP 标记后做检测抗体；
交叉配对测试，选出信号高、背景低、线性好的一对单抗，正式用于 ELISA 试剂盒生产。
十二、抗体标记（适配 ELISA 试剂盒）
选定的检测单抗使用过碘酸钠法偶联 HRP 辣根过氧化物酶，制成酶标抗体；
捕获抗体直接用于酶标板包被工艺。
十三、常见关键注意事项
融合全程无菌操作，一旦污染整孔报废；
PEG 融合时间严格控制，过长细胞大量死亡；
不充分亚克隆会导致细胞株退化、停止产抗；
腹水务必过滤除菌，防止纯化时填料污染；
配对失败最常见原因：两株单抗识别同一抗原表位，无法夹心结合，需多筛几十株克隆交叉配对。
整体周期汇总
免疫：6 周左右
融合 + 筛选 + 亚克隆：4~8 周
腹水制备 + 纯化 + 质控：2~3 周
从零建株总周期：3~5 个月；若外购杂交瘤细胞株，仅需后续扩增纯化，1~2 周即可完成。
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